chatgpt 文爱 嗜热古菌<i>Sulfolobus acidocaldarius</i>核酸内切酶V的重组抒发与酶学特征
DNA当作细胞中蹙迫的遗传物资频频保抓相对褂讪，但由于内源性或外源性身分变成的落拓，DNA会发生不同进度的毁伤和修饰[1]。DNA碱基的脱氨基作用属于DNA毁伤的类型之一，该过程通过水解响应自觉发生，也可能由一些含氮的活性化合物介导发生[1-2]。4种DNA碱基中的3种(腺嘌呤，胞嘧啶和鸟嘌呤)会发生脱氨基响应，诀别产生次黄嘌呤，尿嘧啶和黄嘌呤碱基雷同物。带有脱氨基碱基雷同物的尽头规核苷酸将在DNA复制过程中整合到新合成的DNA中。由于脱氨基碱基雷同物和原始碱基的配对特质不同，尽头规核苷酸具有很强的致突变性[3]。关于带有腺嘌呤的脱氧腺苷(dA，deoxyadenosine)，一方面，一些含氮的活性化合物大约奏凯介导DNA中的脱氧腺苷发生脱氨作用，从而形成脱氧肌苷(dI，deoxyinosine) (图 2-A)。另一方面，一类腺苷脱氨酶(ADA，adenosine deaminase)大约将游离的dA转动为dI，后者大约代谢为次黄嘌呤[4]。次黄嘌呤不错被整合入单磷酸脱氧肌苷(dIMP，deoxyinosine monophosphate)，然后进一步转动为三磷酸脱氧肌苷(dITP，deoxyinosine triphosphate)。dITP也大约通过dATP的自觉脱氨响应产生。在DNA复制过程中，DNA团聚酶将dITP当作底物，其与脱氧胞苷(dC，deoxycytidine)配对，从而导致由A/T解救为C/G的突变。为顶住DNA毁伤，生物体细胞进化出多种类型的DNA毁伤建树计谋。其中，惯例的碱基切除建树(base excision repair)阶梯通过烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(alkyladenine DNA glycosylase)的作用大约一定进度上切除毁伤DNA中的脱氧肌苷[5]。但是，为顶住脱氧肌苷变成的突变，生物体细胞还发展出一种稀奇的针对脱氧肌苷的切除建树功能chatgpt 文爱，该切除建树阶梯由核酸内切酶V (endonuclease V)所肇端。
核酸内切酶V的催化机制为水解位于脱氧肌苷3′端的第二个磷酸二酯键，形成一个3′羟基和一个5′磷酸基团，且只在含有脱氧肌苷的DNA链上形成单个缺口[6]。核酸内切酶V率先发现于大肠杆菌中，由大肠杆菌nfi基因编码[7]。进一步连络标明EcoEndoV在体外具有很广的底物谱，包括错配碱基(base mismatches)，AP位点(apurinic/apyrimidinic sites)，以及一些稀奇的DNA结构[8-9]。此外，遗传学连络证实，在大肠杆菌体内，EcoEndoV在建树含有脱氧肌苷的受损DNA的过程中阐发枢纽作用[10-12]。细菌着手的核酸内切酶V中，海栖热胞菌(Thermotoga maritima)核酸内切酶V (TmaEndoV)的生化连络证实其具有与EcoEndoV相似的底物特异性，并在一定进度上阐发了核酸内切酶V的底物识别和催化机制[13-16]。此外，关于EcoEndoV和TmaEndoV晶体结构的领略为核酸内切酶V的底物识别和催化机制提供了直不雅的阐释[17-19]。
核酸内切酶V在细菌，古菌和真核生物3个生命规模是高度保守的[20]。在真核生物中，小鼠和东说念主类的核酸内切酶V照旧得到表征，其对含脱氧肌苷的受损DNA具有比细菌内切核酸酶V更强的底物特异性[21-22]。此外，有两项连络[3， 23]进一步提议东说念主类的核酸内切酶V施行上为核糖核酸酶，其特异性剪切含肌苷的RNA底物，且在RNA代谢中起相应的作用。在古菌中，关于核酸内切酶V的连络当今相对有限。精通古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的核酸内切酶V (AfuEndoV)是第一个被表征的古菌核酸内切酶V，该核酸内切酶V特异性识别并剪切含有脱氧肌苷的DNA底物[24]。嗜压嗜热球菌(Thermococcus barophilus)的核酸内切酶V (TbaEndoV)雷同具有极强的底物特异性[25]，着手于激猛火球菌(Pyrococcus furiosus)的核酸内切酶V (PfuEndoV)却对含脱氧肌苷的受损DNA和含肌苷的RNA底物均清晰出典型的核酸内切酶V剪切活性[26]。在嗜酸性铁质原生质体(Ferroplasma acidarmanus)中，连络发现一个稀奇的双功能核酸内切酶V，它的底物谱相对较广，含有三类脱氨基碱基(次黄嘌呤，尿嘧啶和黄嘌呤)的DNA均为该酶的方针底物[27]。
硫化叶菌(Sulfolobus)是一类属于泉古菌门的顶点嗜酸嗜热古菌。S. acidocaldarius大约在75-80 ℃的高温下滋长并保抓相对较高的基因组褂讪性[28-29]。鉴于S. acidocaldarius在顶点环境中保抓相对较低基因突变率的特质，该古菌高效的核酸建树系统得到了鄙俗的连络[29]。因此，为加深古菌核酸内切酶V生物功能的连络，本文通过抒发纯化S. acidocaldarius的核酸内切酶V (SacEndoV)，在体外对SacEndoV的核酸酶活性以及酶学特质进行了连络。
1 材料和形式 1.1 材料本实验所用的S. acidocaldarius菌株由德国弗莱堡大学Albers教悔馈遗。大肠杆菌菌株DH5α，Rosetta (DE3)购自北京全式金生物本事有限公司，抒发载体pET28a (+)为本实验室保存。用于扩增目标基因并构建抒发载体的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于测定核酸内切酶V活性的毁伤寡核苷酸底物由铂尚生物本事(上海)有限公司合成，RNA底物由宝生物工程(大连)有限公司合成，底物序列见表 1。DNA Ladder、卵白Marker、PrimSTAR DNA团聚酶均购自TaKaRa公司。基因组索求试剂盒，质粒索求试剂盒，PCR产物纯化和胶回收试剂盒，Brandford卵白浓度测定试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。ClonExpress II One Step Cloning试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司。Ni-NTA卵白纯化树脂为Bio-Rad公司居品。
1.2 抒发载体构建以S.acidocaldarius基因组DNA当作模板，通过PCR扩增核酸内切酶V (Saci_0544)的基因。正向引物序列为5′-GCAGGCTCGCATATGGAAG ATTTTATGATAGA-3′，反向引物序列为5′-GCT GGGTTCGGATCCTTATTCTTTTTTCTTTAGCTC-3′。再用PCR扩增的形式线性化pET28a质粒，正向引物序列为5′-GGATCCGAACCCAGCAA TTCGAGCTCCGTCGACAAG-3′，反向引物序列为5′-CATATGCGAGCCTGCACCCTGGAAGTAC AGGTTTTC-3′。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化。用ClonExpress II重组克隆试剂盒贯串核酸内切酶V基因和线性化的pET28a质粒，取重组贯串产物转动入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落PCR断然阳性克隆，并进行DNA测序，详情核酸内切酶V的基因序列是否准确无误，最终赢得抒发载体pET28a(+)-Saci_0544。
在pET28a(+)-Saci_0544的基础上，对SacEndoV基因进行点突变，以构建失活突变体。以pET28a(+)-Saci_0544为模板，通过PCR扩增该抒发载体，正向引物序列为5′-TGGTGTTGCC ATAGCTTATAAGGGAAATATAG-3′，反向引物序列为5′-AAGCTATGGCAACACCACATAAATTC TTTAT-3′。将PCR产物与ClonExpress II重组酶在37 ℃下孵育30 min后转动到大肠杆菌DH5α细胞中，挑取单克隆菌落进行DNA测序，以阐发突变体是否构建得胜。
1.3 重组卵白的指令抒发和纯化将重组抒发载体pET28a(+)-Saci_0544转动到大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中。挑取阳性单克隆在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中逐级放大培养。待大肠杆菌培养液的OD600达到0.6-0.8，向培养液中加入IPTG (isopropy-β-D-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度0.5 mmol/L，20 ℃培养18 h，指令重组卵白抒发。培养完成后，离心(4 ℃，8000 r/min，4 min)网罗细菌体。菌体千里淀用裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，10%甘油)重悬，并通过超声法破灭。离心分离(4 ℃，10000 r/min，40 min)裂解产物并网罗上清液。将Ni-NTA树脂装填到亲和层析柱中，事前用5倍树脂体积的裂解缓冲液在4 ℃下均衡Ni-NTA树脂1 h。然后，将离心上清液加入层析柱中，用10倍柱体积的洗涤缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，10%甘油)洗涤树脂，去除非特异性纠合的大肠杆菌卵白。方针卵白以洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，10%甘油)洗脱网罗。通过15% SDS-PAGE详情卵白质的分子量及纯度，超滤法将方针卵白置换到储存缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，100 mmol/L NaCl，50%甘油)中。卵白浓度通过Bradford法测定。
1.4 SacEndoV内切核酸酶V活性测定用以检测SacEndoV的核酸内切酶V活性的寡核苷酸底物序列见表 1，部分底物5′端带有FAM荧光标志。将带有5′ FAM标志的单链底物与其互补单链夹杂于退火缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L NaCl)中，80 ℃加热5 min，当然降温至室温，退火形成双链底物。SacEndoV的要领活性测定响应体系(20 μL)包括：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1.0 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L DTT，50 nmol/L荧光标志底物和不同浓度的SacEndoV卵白。要领活性测定响应在55 ℃下进行15 min，加入20 μL响应闭幕液(50 mmol/L EDTA，0.2% SDS，0.1%溴酚蓝，90%甲酰胺)闭幕响应。将响应溶液在95 ℃加热5 min，并在冰上冷却后，立行将样品上样到含有8 mol/L尿素的15%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳规则后，凝胶由Amersham Typhoon RGB生物分子成像仪扫描成像，电泳后果的定量分析通过ImageQuant软件进行。
SacEndoV的生化特质表征。响应温度对SacEndoV活性影响的实验在40 ℃至95 ℃的响应温度下进行15 min，响应缓冲液(20 μL)构成为20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1.0 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L DTT，50 nmol/L荧光标志底物。使用不同二价离子(包括Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Co2+)来详情离子种类对SacEndoV活性的影响，响应体系中总共二价离子的浓度均为1.0 mmol/L，响应在55 ℃下进行15 min。Mg2+和Mn2+的最好响应浓度优化实验的Mg2+和Mn2+的浓度规模为0.1 mmol/L至8.0 mmol/L，响应在55 ℃下进行15 min。通过在不同响应pH下测定酶活性，详情SacEndoV的最好响应pH。pH规模为5.0-10.5，响应在55 ℃下进行15 min。用MES-NaOH制备pH 5.0-7.0的缓冲液chatgpt 文爱，用Tris-HCl制备pH 7.0-9.0的缓冲液，用Gly-NaOH制备pH 9.0-10.5的缓冲液。SacEndoV的耐盐性实验中，响应缓冲液中NaCl的终浓度诀别为50、100、200、300、400、500 mmol/L，响应在55 ℃下进行15 min。
2 后果和分析 2.1 SacEndoV过火失活突变体的抒发纯化将pET28a(+)-Saci_0544抒发载体转动到E. coli Rosetta (DE3)抒发菌株中指令抒发SacEndoV卵白，抒发纯化后果见图 1-A。卵白样品经15% SDS-PAGE电泳检测，清晰彰着的目标卵白条带，目标卵白的纯度达到90%以上。通过与要领卵白Marker比较，方针卵白的分子量约为23.0 kDa，与SacEndoV的表面策动值(22.65 kDa)相符。
对PfuEndoV的连络标明，突变35位的天冬氨酸残基将导致该酶丧失核酸内切酶V活性[26]，而且在TmaEndoV的连络中预计该保守氨基酸残基为核酸内切酶V纠合Mg2+的枢纽氨基酸残基之一[16]。因此，本连络对部分着手于古菌和细菌的核酸内切酶V序列进行多序列比对分析(图 1-B)。后果标明，PfuEndoV的35位的天冬氨酸残基在SacEndoV以过火他参与比对的核酸内切酶V序列中高度保守。在此基础上，本连络构建了一个将37位天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基的SacEndoV失活突变体，当作野生型SacEndoV的阴性对照。经过与野生型SacEndoV相易的抒发纯化经过，得到突变体卵白SacEndoV-D37A (图 1-A)。
2.2 SacEndoV核酸内切酶V的活性SacEndoV关于本连络所使用的毁伤DNA底物的剪切机制见图 2-B。经过要领核酸内切酶V活性测定响应，响应产物清晰出与要领Marker大小十足一致的单一条带(图 2-C)，标明SacEndoV具有典型的核酸内切酶V活性。为了进一步详情SacEndoV的核酸内切酶V活性，利器用有不同配对方式的双链毁伤DNA底物检测SacEndoV的剪切活性(图 2-C)。后果清晰SacEndoV对总共双链DNA底物均具有核酸内切酶V活性，但比较于单链DNA，SacEndoV对双链DNA的剪切活性相对更低。同期，SacEndoV的失活突变体关于单链和双链毁伤DNA底物均不具备剪切活性，标明野生型SacEndoV的核酸内切酶V活性不是来自纯化过程中残留大肠杆菌核酸内切酶V的污辱。
本连络进一步有计划SacEndoV是否以浓度依赖的方式剪切毁伤DNA底物。从图 2-D中可看出，SacEndoV对毁伤DNA底物的剪切活性呈现酶浓度依赖性，且跟着酶浓度的升高而增强。在相易的酶浓度下，SacEndoV关于单链DNA底物的活性权贵高于双链DNA底物，阐述在体外SacEndoV偏好单链景况的毁伤DNA底物。
关于PfuEndoV的连络标明其具有雷同于东说念主类核酸内切酶V的关于RNA底物的活性[26]，本连络初步有计划了SacEndoV是否具有针对RNA中带有次黄嘌呤的肌苷(I，Inosine)的内切酶活性。后果如图 2-E所示，SacEndoV关于含I的单链和双链RNA均具有彰着的剪切活性，且关于单链RNA底物的剪切活性高于双链RNA。可见，在体外，SacEndoV关于含I的RNA底物具有剪切活性，且其关于毁伤RNA底物的剪切活性是与毁伤DNA底物相似的。同期，SacEndoV的失活突变体关于单链和双链RNA底物均未阐发出剪切活性，标明其关于RNA底物的活性不是来自于外源卵白的污辱。
2.3 SacEndoV生化特质的表征SacEndoV经初步测定具有典型的核酸内切酶V活性，为进一步了解其生化特质，本连络对该酶进行了生化表征，后果见图 3。当响应温度为40-65 ℃时，SacEndoV的底物剪切率相对较低(8%-65%)。而响应温度高于70 ℃时，SacEndoV的活性急剧升高，底物剪切率接近100%，且跟着温度升高SacEndoV的底物剪切率投入平台期(图 3-A)。因此，SacEndoV在70-95 ℃的温度规模内具有很高的核酸内切酶V活性。
基于顶点嗜热古菌核酸内切酶V的连络[25-26]，本连络聘任Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Ni2+和Co2+有计划不同二价金属离子对SacEndoV活性的影响(图 3-B)。当响应体系中添加Zn2+和Ca2+，SacEndoV莫得检测到剪切活性。但是，当Mg2+、Mn2+、Ni2+和Co2+存在时，SacEndoV关于含脱氧肌苷的DNA底物均阐发出彰着的剪切活性。因此，SacEndoV的核酸内切酶活性以二价金属离子当作扶持因子，且多样二价金属离子的扶持作用为Mg2+ > Mn2+≈Ni2+ > Co2+ > Zn2+≈Ca2+。此外，图 3-C标明，过高浓度的Mg2+和Mn2+将扼制SacEndoV的核酸内切酶活性。但SacEndoV关于Mg2+的耐受进度相对更高，其最优响应浓度在0.5-2.0 mmol/L的规模内。
把柄图 3-D的后果，SacEndoV的最优响应pH区间为7.5-8.0。在相对强的酸性和碱性pH规模内(pH < 6.5，pH > 10.0)，SacEndoV活性急剧镌汰，尽头是当pH低于5.5时，该酶基本失活。此外，SacEndoV最好的响应NaCl浓度应当低于50 mmol/L (图 3-E)。当NaCl浓度高于200 mmol/L时，其剪切活性受到彰着的扼制，标明SacEndoV对高浓度NaCl不具备耐受性。
2.4 SacEndoV的热褂讪性鉴于SacEndoV在70-95 ℃具有致密的剪切活性，本连络进一步有计划该酶在高温下的热褂讪性，后果见图 4。将SacEndoV在一系列温度下孵育10、20、40和80 min，然后在要领响应条目下测定酶的残留活性(图 4-A)。当温育温度为55 ℃时，不雅察到SacEndoV褂讪性较强，而且温育80 min后，它仍保留了部分剪切活性(20%)。但是，跟着孵育温度的升高，SacEndoV的褂讪性急剧下落。尽管在75 ℃孵育10 min后，SacEndoV仍不错保留部分剪切活性(60%)，但在85 ℃和95 ℃下孵育10 min后，残余的酶活性十分微弱(20%和10%)。这一后果与部分着手于嗜热古菌的核酸内切酶V并不一致[25-26]。
为进一步考据SacEndoV在高温下的酶活性，在镌汰响应体系酶浓度的前提下同步测定了SacEndoV的活性和热褂讪性(图 4-B和图 4-C)。在75-95 ℃的高温下，跟着响当令刻的延迟，SacEndoV对底物的剪切率徐徐增大。而且在4-6 min的响当令刻内，不同响应温度下总共酶的底物剪切活性即达到弥散。同期，在相易的响当令刻内，跟着响应温度的升高，SacEndoV的底物剪切率小幅升高(图 4-B)。因此，SacEndoV如确切高温环境下具有很高的酶活性。此外，该后果阐述，图 3-A中，SacEndoV的底物剪切率投入平台期，是由于在响应体系中酶浓度较高的前提下，当响应温度高于70 ℃，温度升高对酶活性的促进作用导致SacEndoV在15 min内简直将底物十足剪切(底物剪切率接近100%)，从而不同响应温度间未清晰权贵的剪切活性相反。但是，跟着孵育时刻的延迟，SacEndoV残余的酶活性却徐徐镌汰(图 4-C)，标明SacEndoV在高温下保抓高酶活性有可能是酶纠合底物后，增强了其褂讪性所致。
2.5 SacEndoV对不同毁伤DNA底物的聘任性连络标明，EcoEndoV和TmaEndoV均具有平时的底物谱[9， 13]。在此基础上，本连络愚弄带有多样不同类型毁伤的DNA当作底物，有计划SacEndoV的底物特异性(图 5)。如图 5-A所示，本连络测定了SacEndoV关于带有3种脱氨基碱基，AP位点以及4种正常碱基的DNA底物的剪切活性，后果标明其仅剪切含有脱氧肌苷的毁伤DNA底物。同期，一系列带有4种惯例碱基总共错配类型的双链DNA底物被用于测定SacEndoV的剪切活性(图 5-B和图 5-C)。后果标明，SacEndoV对总共包含错配位点的DNA底物均莫得可不雅察到的剪切活性。可见，不同于细菌着手的EcoEndoV和TmaEndoV，SacEndoV对含有脱氧肌苷的毁伤DNA底物具有极强的底物特异性。
2.6 底物中特定核苷酸结构齐全性对SacEndoV内切核酸酶活性的影响鉴于核酸内切酶V的典型活性，咱们算计DNA底物中脱氧肌苷3′打量邻的脱氧核糖核苷酸关于核酸内切酶V阐发剪切活性具有蹙迫道理。因此，愚弄脱氧肌苷3′打量邻的脱氧核糖核苷酸被AP位点(无嘧啶/无嘌呤位点)替代的稀奇底物，本连络有计划了该核苷酸的结构齐全性是否对SacEndoV的剪切活性产生影响。图 6-A的后果标明，SacEndoV对这类稀奇底物不具备权贵的剪切活性，且取代3′端脱氧核糖核苷酸的AP位点的类型对后果无权贵影响。本连络进一步测定SacEndoV对脱氧肌苷5′打量邻脱氧核糖核苷酸被AP位点取代的底物的剪切活性(图 6-B)。后果标明，此类型的毁伤DNA底物关于SacEndoV的剪切活性无权贵影响。此外，在双链DNA景况下，关于该稀奇核苷酸结构不齐全所变成的SacEndoV活性缺失，互补链上对应的惯例核苷酸不具备彰着的抵偿效应(图 6-C)。因此，本连络初步详情，与脱氧肌苷3′打量邻的脱氧核糖核苷酸结构齐全性关于SacEndoV识别并剪切有关底物极其枢纽。
3 揣度现存连络照旧阐发核酸内切酶V在体外对毁伤DNA底物的剪切机制为水解位于脱氧肌苷3′端的第二个磷酸二酯键。据此，本连络证实SacEndoV关于含脱氧肌苷的毁伤DNA清晰出典型的核酸内切酶V活性，相较于双链DNA底物，SacEndoV在体外对单链DNA底物具有彰着的偏好性。SacEndoV展现底物偏好性的算计原因为双链DNA的二级结构或者互补链上的配对碱基与氢键一定进度上退却了SacEndoV交往并识别次黄嘌呤。古菌着手的核酸内切酶V中，TbaEndo V具有与SacEndoV一致的偏好性[25]，但此特质的生物学道理需要在生物体内进行进一步的有计划。此外，SacEndoV的底物谱尽头窄，仅对含有脱氧肌苷的毁伤DNA底物阐发出剪切活性。就底物特异性而言，大部分古菌内切核酸酶V与SacEndoV一致[24-26]，但来自F. acidarmanus的双功能内切核酸V底物谱相对更广[27]。因此，除尽头规的内切核酸酶V外，古菌着手的核酸内切酶V倾向于对带有脱氧肌苷的毁伤DNA阐发出极强的底物特异性。此外，除毁伤DNA底物，SacEndoV关于含I的RNA底物雷同具有剪切活性，这一特质与PfuEndoV以及东说念主类核酸内切酶V是一致的[23， 26]。鉴于核酸内切酶V相对稀奇的底物剪切机制，底物中除脱氧肌苷外，与脱氧肌苷的3′打量邻的脱氧核糖核苷酸是一个具有蹙迫道理的核苷酸。基于本文的连络后果，该脱氧核糖核苷酸上碱基的存在关于SacEndoV剪切含脱氧肌苷的DNA底物是必要的，但尚省略情该核苷酸其他部分的齐全性是否也对酶的活性产生重要影响。关于SacEndoV过火底物复合物晶体结构的领略将有助于进一步阐发该无礼的具体机制。
SacEndoV的生化表征标明，该核酸内切酶在70-95 ℃的温度规模内具有极高的剪切活性。这与S. acidocaldarius的最适滋长温度相对一致，一定进度上展现出身物关于滋长环境的顺应性。顶点嗜热古菌在高温环境中濒临着以更高的概率和速度发生DNA脱氨基作用的风险[30]。SacEndoV对毁伤DNA底物极高的剪切活性有助于S. acidocaldarius在高温环境下保管基因组的褂讪性。尽管SacEndoV在高温下具有极高的剪切活性，进一步连络标明其在体外可能不具备致密的热褂讪性。由此推断，在高温导致其活性徐徐丧失之前，SacEndoV极高的核酸内切酶活性确保其大约快速完成毁伤DNA底物的剪切。此外，SacEndoV展现这一特质的另一可能机制为SacEndoV与底物纠合后，所形成的酶和底物的复合物的使得其本人的结构变得愈加褂讪。即底物的保护作用进步了SacEndoV的热褂讪性，使其在高温下保抓极高的底物剪切活性。
二价金属离子是核酸内切酶V保管底物剪切活性必要的扶持因子。SacEndoV在Mg2+，Mn2+，Ni2+和Co2+存在时清晰出典型的核酸内切酶V活性，但在Zn2+，Ca2+存在时则无法检测到剪切活性。关于总共古菌着手的核酸内切酶V，Mg2+和Mn2+为有助于其保管较高核酸内切酶活性的两种典型辅因子。与SacEndoV相似，PfuEndoV[26]更偏好Mg2+当作辅因子，但关于TbaEndoV[25]而言，Mg2+和Mn2+对其活性的影响简直是一致的。此外，Ni2+当作辅因子时，SacEndoV和TbaEndo V[25]对含脱氧肌苷的DNA底物阐发出剪切活性，但其对PfuEndoV[26]则不具备扶持作用。在Co2+存在的情况下，SacEndoV仍保抓相对微弱的底物剪切活性，而当今在其他的古菌核酸内切酶V中莫得不雅察到Co2+的扶持作用。可见，古菌核酸内切酶V需要二价金属离子当作扶持因子，但对二价金属离子类型的偏好性在不同物种之间略有不同。
核酸内切酶V在剪切含有脱氧肌苷的毁伤DNA后，仍会与底物保抓细腻的纠合[31]。此外，核酸内切酶V无法将脱氧肌苷从毁伤DNA中切除，因此核酸内切酶V需要招募其他的建树酶来完成脱氧肌苷后续的建树过程。固然当今关于脱氧肌苷后续建树过程的了解很少，但针对该稀奇建树阶梯提议了多种假说。一类假说提议，DNA团聚酶可能参与脱氧肌苷的切除建树。在大肠杆菌中，前东说念主报说念了一个触及核酸内切酶V，DNA团聚酶I和DNA贯串酶的脱氧肌苷建树模子。该模子中，DNA团聚酶I的3′-5′核酸外切酶活性在脱氧肌苷的去除中起主要作用[32-33]。在古菌中，不错识别次黄嘌呤的DNA团聚酶B被觉得与脱氧肌苷的建树有关，具体的建树机制仍有待阐发[26]。特定的一些具有5′核酸内切酶活性的建树酶也被觉得大约协助脱氧肌苷的切除。古菌着手的核酸内切酶Q是一种新式核酸内切酶，其具备从毁伤碱基的5′端剪切含脱氧肌苷的DNA底物的催化活性[34]。因此，核酸内切酶Q具有与核酸内切酶V协同建树脱氧肌苷的后劲[25]。具有3′核酸外切酶活性的核酸酶是另一类协助切除脱氧肌苷的潜在建树酶。P. furiosus的AP核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease)具有3′-5′核酸外切酶活性，标明在核酸内切酶V剪切毁伤的DNA链后，其也许大约从缺口处切除脱氧肌苷[35]。当以Mn2+当作扶持因子时，TmaEndoV也阐发出3′-5′核酸外切酶活性，但该性质似乎是TmaEndoV独到的[13]。
小77论坛文学欣赏本连络断然并表征了S. acidocaldarius内切核酸酶V，这是第一个关于Sulfolobus属着手的内切核酸酶V生化功能和酶学特征的连络。S. acidocaldarius是连络古菌在高温条目下保管基因组齐全性的模式菌株之一。因此chatgpt 文爱，关于SacEndoV的连络有助于丰富古菌着手核酸内切酶V的连络内容，加深关于古菌核酸内切酶V的了解，也为进一步领略S. acidocaldarius脱氧肌苷切除建树阶梯奠定了基础。