福利姬 自慰 嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组抒发与酶学特征
DNA行动细胞中迫切的遗传物资通常保捏相对褂讪，但由于内源性或外源性身分酿成的破裂，DNA会发生不同进程的损害和修饰[1]。DNA碱基的脱氨基作用属于DNA损害的类型之一，该过程通过水解反馈自觉发生，也可能由一些含氮的活性化合物介导发生[1-2]。4种DNA碱基中的3种(腺嘌呤，胞嘧啶和鸟嘌呤)会发生脱氨基反馈，区别产生次黄嘌呤，尿嘧啶和黄嘌呤碱基肖似物。带有脱氨基碱基肖似物的特殊规核苷酸将在DNA复制过程中整合到新合成的DNA中。由于脱氨基碱基肖似物和原始碱基的配对特质不同，特殊规核苷酸具有很强的致突变性[3]。关于带有腺嘌呤的脱氧腺苷(dA，deoxyadenosine)，一方面，一些含氮的活性化合物或者平直介导DNA中的脱氧腺苷发生脱氨作用，从而形成脱氧肌苷(dI，deoxyinosine) (图 2-A)。另一方面，一类腺苷脱氨酶(ADA福利姬 自慰，adenosine deaminase)或者将游离的dA转机为dI，后者或者代谢为次黄嘌呤[4]。次黄嘌呤不错被整合入单磷酸脱氧肌苷(dIMP，deoxyinosine monophosphate)，然后进一步转机为三磷酸脱氧肌苷(dITP，deoxyinosine triphosphate)。dITP也或者通过dATP的自觉脱氨反馈产生。在DNA复制过程中，DNA团聚酶将dITP行动底物，其与脱氧胞苷(dC，deoxycytidine)配对，从而导致由A/T调理为C/G的突变。为豪放DNA损害，生物体细胞进化出多种类型的DNA损害培植计策。其中，成例的碱基切除培植(base excision repair)路线通过烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(alkyladenine DNA glycosylase)的作用或者一定进程上切除损害DNA中的脱氧肌苷[5]。但是，为豪放脱氧肌苷酿成的突变，生物体细胞还发展出一种非常的针对脱氧肌苷的切除培植功能，该切除培植路线由核酸内切酶V (endonuclease V)所肇始。
核酸内切酶V的催化机制为水解位于脱氧肌苷3′端的第二个磷酸二酯键，形成一个3′羟基和一个5′磷酸基团，且只在含有脱氧肌苷的DNA链上形成单个缺口[6]。核酸内切酶V率先发现于大肠杆菌中，由大肠杆菌nfi基因编码[7]。进一步谈判标明EcoEndoV在体外具有很广的底物谱，包括错配碱基(base mismatches)，AP位点(apurinic/apyrimidinic sites)，以及一些非常的DNA结构[8-9]。此外，遗传学谈判证实，在大肠杆菌体内，EcoEndoV在培植含有脱氧肌苷的受损DNA的过程中阐明要害作用[10-12]。细菌着手的核酸内切酶V中，海栖热胞菌(Thermotoga maritima)核酸内切酶V (TmaEndoV)的生化谈判证实其具有与EcoEndoV相似的底物特异性，并在一定进程上阐明了核酸内切酶V的底物识别和催化机制[13-16]。此外，关于EcoEndoV和TmaEndoV晶体结构的阐明为核酸内切酶V的底物识别和催化机制提供了直不雅的阐释[17-19]。
核酸内切酶V在细菌，古菌和真核生物3个人命规模是高度保守的[20]。在真核生物中，小鼠和东说念主类的核酸内切酶V仍是得到表征，其对含脱氧肌苷的受损DNA具有比细菌内切核酸酶V更强的底物特异性[21-22]。此外，有两项谈判[3， 23]进一步建议东说念主类的核酸内切酶V内容上为核糖核酸酶，其特异性剪切含肌苷的RNA底物，且在RNA代谢中起相应的作用。在古菌中，关于核酸内切酶V的谈判现在相对有限。耀眼古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的核酸内切酶V (AfuEndoV)是第一个被表征的古菌核酸内切酶V，该核酸内切酶V特异性识别并剪切含有脱氧肌苷的DNA底物[24]。嗜压嗜热球菌(Thermococcus barophilus)的核酸内切酶V (TbaEndoV)雷同具有极强的底物特异性[25]，着手于激猛火球菌(Pyrococcus furiosus)的核酸内切酶V (PfuEndoV)却对含脱氧肌苷的受损DNA和含肌苷的RNA底物均阐明出典型的核酸内切酶V剪切活性[26]。在嗜酸性铁质原生质体(Ferroplasma acidarmanus)中，谈判发现一个非常的双功能核酸内切酶V，它的底物谱相对较广，含有三类脱氨基碱基(次黄嘌呤，尿嘧啶和黄嘌呤)的DNA均为该酶的打算底物[27]。
硫化叶菌(Sulfolobus)是一类属于泉古菌门的顶点嗜酸嗜热古菌。S. acidocaldarius或者在75-80 ℃的高温下助长并保捏相对较高的基因组褂讪性[28-29]。鉴于S. acidocaldarius在顶点环境中保捏相对较低基因突变率的特质，该古菌高效的核酸培植系统得到了泛泛的谈判[29]。因此，为加深古菌核酸内切酶V生物功能的谈判，本文通过抒发纯化S. acidocaldarius的核酸内切酶V (SacEndoV)，在体外对SacEndoV的核酸酶活性以及酶学特质进行了谈判。
1 材料和枢纽 1.1 材料本践诺所用的S. acidocaldarius菌株由德国弗莱堡大学Albers造就赠给。大肠杆菌菌株DH5α，Rosetta (DE3)购自北京全式金生物工夫有限公司，抒发载体pET28a (+)为本践诺室保存。用于扩增见地基因并构建抒发载体的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于测定核酸内切酶V活性的损害寡核苷酸底物由铂尚生物工夫(上海)有限公司合成，RNA底物由宝生物工程(大连)有限公司合成，底物序列见表 1。DNA Ladder、卵白Marker、PrimSTAR DNA团聚酶均购自TaKaRa公司。基因组索要试剂盒，质粒索要试剂盒，PCR产物纯化和胶回收试剂盒，Brandford卵白浓度测定试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。ClonExpress II One Step Cloning试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司。Ni-NTA卵白纯化树脂为Bio-Rad公司家具。
1.2 抒发载体构建以S.acidocaldarius基因组DNA行动模板，通过PCR扩增核酸内切酶V (Saci_0544)的基因。正向引物序列为5′-GCAGGCTCGCATATGGAAG ATTTTATGATAGA-3′，反向引物序列为5′-GCT GGGTTCGGATCCTTATTCTTTTTTCTTTAGCTC-3′。再用PCR扩增的枢纽线性化pET28a质粒，正向引物序列为5′-GGATCCGAACCCAGCAA TTCGAGCTCCGTCGACAAG-3′，反向引物序列为5′-CATATGCGAGCCTGCACCCTGGAAGTAC AGGTTTTC-3′。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化。用ClonExpress II重组克隆试剂盒畅达核酸内切酶V基因和线性化的pET28a质粒，取重组畅达产物转机入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落PCR果决阳性克隆，并进行DNA测序，细目核酸内切酶V的基因序列是否准确无误，最终得回抒发载体pET28a(+)-Saci_0544。
在pET28a(+)-Saci_0544的基础上，对SacEndoV基因进行点突变，以构建失活突变体。以pET28a(+)-Saci_0544为模板，通过PCR扩增该抒发载体，正向引物序列为5′-TGGTGTTGCC ATAGCTTATAAGGGAAATATAG-3′，反向引物序列为5′-AAGCTATGGCAACACCACATAAATTC TTTAT-3′。将PCR产物与ClonExpress II重组酶在37 ℃下孵育30 min后转机到大肠杆菌DH5α细胞中，挑取单克隆菌落进行DNA测序，以证明突变体是否构建成效。
1.3 重组卵白的带领抒发和纯化将重组抒发载体pET28a(+)-Saci_0544转机到大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中。挑取阳性单克隆在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中逐级放大培养。待大肠杆菌培养液的OD600达到0.6-0.8，向培养液中加入IPTG (isopropy-β-D-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度0.5 mmol/L，20 ℃培养18 h，带领重组卵白抒发。培养完成后，离心(4 ℃，8000 r/min，4 min)相聚细菌体。菌体千里淀用裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，10%甘油)重悬，并通过超声法幻灭。离心分离(4 ℃，10000 r/min，40 min)裂解产物并相聚上清液。将Ni-NTA树脂装填到亲和层析柱中，事前用5倍树脂体积的裂解缓冲液在4 ℃下均衡Ni-NTA树脂1 h。然后，将离心上清液加入层析柱中，用10倍柱体积的洗涤缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，10%甘油)洗涤树脂，去除非特异性集合的大肠杆菌卵白。打算卵白以洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，日本萝莉300 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，10%甘油)洗脱相聚。通过15% SDS-PAGE细目卵白质的分子量及纯度，超滤法将打算卵白置换到储存缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，100 mmol/L NaCl，50%甘油)中。卵白浓度通过Bradford法测定。
1.4 SacEndoV内切核酸酶V活性测定用以检测SacEndoV的核酸内切酶V活性的寡核苷酸底物序列见表 1，部分底物5′端带有FAM荧光标志。将带有5′ FAM标志的单链底物与其互补单链夹杂于退火缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L NaCl)中，80 ℃加热5 min，天然降温至室温，退火形成双链底物。SacEndoV的轨范活性测定反馈体系(20 μL)包括：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1.0 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L DTT，50 nmol/L荧光标志底物和不同浓度的SacEndoV卵白。轨范活性测定反馈在55 ℃下进行15 min，加入20 μL反馈圮绝液(50 mmol/L EDTA，0.2% SDS，0.1%溴酚蓝，90%甲酰胺)圮绝反馈。将反馈溶液在95 ℃加热5 min，并在冰上冷却后，立行将样品上样到含有8 mol/L尿素的15%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳截止后，凝胶由Amersham Typhoon RGB生物分子成像仪扫描成像，电泳恶果的定量分析通过ImageQuant软件进行。
SacEndoV的生化特质表征。反馈温度对SacEndoV活性影响的践诺在40 ℃至95 ℃的反馈温度下进行15 min，反馈缓冲液(20 μL)构成为20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1.0 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L DTT，50 nmol/L荧光标志底物。使用不同二价离子(包括Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Co2+)来细目离子种类对SacEndoV活性的影响，反馈体系中扫数二价离子的浓度均为1.0 mmol/L，反馈在55 ℃下进行15 min。Mg2+和Mn2+的最好反馈浓度优化践诺的Mg2+和Mn2+的浓度范围为0.1 mmol/L至8.0 mmol/L，反馈在55 ℃下进行15 min。通过在不同反馈pH下测定酶活性，细目SacEndoV的最好反馈pH。pH范围为5.0-10.5，反馈在55 ℃下进行15 min。用MES-NaOH制备pH 5.0-7.0的缓冲液，用Tris-HCl制备pH 7.0-9.0的缓冲液，用Gly-NaOH制备pH 9.0-10.5的缓冲液。SacEndoV的耐盐性践诺中，反馈缓冲液中NaCl的终浓度区别为50、100、200、300、400、500 mmol/L，反馈在55 ℃下进行15 min。
2 恶果和分析 2.1 SacEndoV过火失活突变体的抒发纯化将pET28a(+)-Saci_0544抒发载体转机到E. coli Rosetta (DE3)抒发菌株中带领抒发SacEndoV卵白，抒发纯化恶果见图 1-A。卵白样品经15% SDS-PAGE电泳检测，阐明浮现的见地卵白条带，见地卵白的纯度达到90%以上。通过与轨范卵白Marker比较，打算卵白的分子量约为23.0 kDa，与SacEndoV的表面意想值(22.65 kDa)相符。
对PfuEndoV的谈判标明，突变35位的天冬氨酸残基将导致该酶丧失核酸内切酶V活性[26]，况兼在TmaEndoV的谈判中瞻望该保守氨基酸残基为核酸内切酶V集合Mg2+的要害氨基酸残基之一[16]。因此，本谈判对部分着手于古菌和细菌的核酸内切酶V序列进行多序列比对分析(图 1-B)。恶果标明，PfuEndoV的35位的天冬氨酸残基在SacEndoV以过火他参与比对的核酸内切酶V序列中高度保守。在此基础上，本谈判构建了一个将37位天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基的SacEndoV失活突变体，行动野生型SacEndoV的阴性对照。经过与野生型SacEndoV调换的抒发纯化经过，得到突变体卵白SacEndoV-D37A (图 1-A)。
2.2 SacEndoV核酸内切酶V的活性SacEndoV关于本谈判所使用的损害DNA底物的剪切机制见图 2-B。经过轨范核酸内切酶V活性测定反馈，反馈产物阐明出与轨范Marker大小十足一致的单一条带(图 2-C)，标明SacEndoV具有典型的核酸内切酶V活性。为了进一步细目SacEndoV的核酸内切酶V活性，利器具有不同配对神气的双链损害DNA底物检测SacEndoV的剪切活性(图 2-C)。恶果阐明SacEndoV对扫数双链DNA底物均具有核酸内切酶V活性，但比较于单链DNA，SacEndoV对双链DNA的剪切活性相对更低。同期，SacEndoV的失活突变体关于单链和双链损害DNA底物均不具备剪切活性，标明野生型SacEndoV的核酸内切酶V活性不是来自纯化过程中残留大肠杆菌核酸内切酶V的耻辱。
本谈判进一步探究SacEndoV是否以浓度依赖的神气剪切损害DNA底物。从图 2-D中可看出，SacEndoV对损害DNA底物的剪切活性呈现酶浓度依赖性，且跟着酶浓度的升高而增强。在调换的酶浓度下，SacEndoV关于单链DNA底物的活性权贵高于双链DNA底物，证明在体外SacEndoV偏好单链景况的损害DNA底物。
关于PfuEndoV的谈判标明其具有肖似于东说念主类核酸内切酶V的关于RNA底物的活性[26]，本谈判初步探究了SacEndoV是否具有针对RNA中带有次黄嘌呤的肌苷(I，Inosine)的内切酶活性。恶果如图 2-E所示，SacEndoV关于含I的单链和双链RNA均具有浮现的剪切活性，且关于单链RNA底物的剪切活性高于双链RNA。可见，在体外，SacEndoV关于含I的RNA底物具有剪切活性，且其关于损害RNA底物的剪切活性是与损害DNA底物相似的。同期，SacEndoV的失活突变体关于单链和双链RNA底物均未表现出剪切活性，标明其关于RNA底物的活性不是来自于外源卵白的耻辱。
2.3 SacEndoV生化特质的表征SacEndoV经初步测定具有典型的核酸内切酶V活性，为进一步了解其生化特质，本谈判对该酶进行了生化表征，恶果见图 3。当反馈温度为40-65 ℃时，SacEndoV的底物剪切率相对较低(8%-65%)。而反馈温度高于70 ℃时，SacEndoV的活性急剧升高，底物剪切率接近100%，且跟着温度升高SacEndoV的底物剪切率干涉平台期(图 3-A)。因此，SacEndoV在70-95 ℃的温度范围内具有很高的核酸内切酶V活性。
基于顶点嗜热古菌核酸内切酶V的谈判[25-26]，本谈判聘请Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Ni2+和Co2+探究不同二价金属离子对SacEndoV活性的影响(图 3-B)。当反馈体系中添加Zn2+和Ca2+，SacEndoV莫得检测到剪切活性。但是，当Mg2+、Mn2+、Ni2+和Co2+存在时，SacEndoV关于含脱氧肌苷的DNA底物均表现出浮现的剪切活性。因此，SacEndoV的核酸内切酶活性以二价金属离子行动扶植因子，且多样二价金属离子的扶植作用为Mg2+ > Mn2+≈Ni2+ > Co2+ > Zn2+≈Ca2+。此外，图 3-C标明，过高浓度的Mg2+和Mn2+将扼制SacEndoV的核酸内切酶活性。但SacEndoV关于Mg2+的耐受进程相对更高，其最优反馈浓度在0.5-2.0 mmol/L的范围内。
凭证图 3-D的恶果，SacEndoV的最优反馈pH区间为7.5-8.0。在相对强的酸性和碱性pH范围内(pH < 6.5，pH > 10.0)，SacEndoV活性急剧镌汰，尽头是当pH低于5.5时，该酶基本失活。此外，SacEndoV最好的反馈NaCl浓度应当低于50 mmol/L (图 3-E)。当NaCl浓度高于200 mmol/L时，其剪切活性受到浮现的扼制，标明SacEndoV对高浓度NaCl不具备耐受性。
2.4 SacEndoV的热褂讪性鉴于SacEndoV在70-95 ℃具有细密的剪切活性，本谈判进一步探究该酶在高温下的热褂讪性，恶果见图 4。将SacEndoV在一系列温度下孵育10、20、40和80 min，然后在轨范反馈条款下测定酶的残留活性(图 4-A)。当温育温度为55 ℃时，不雅察到SacEndoV褂讪性较强，况兼温育80 min后，它仍保留了部分剪切活性(20%)。但是，跟着孵育温度的升高，SacEndoV的褂讪性急剧着落。尽管在75 ℃孵育10 min后，SacEndoV仍不错保留部分剪切活性(60%)，但在85 ℃和95 ℃下孵育10 min后，残余的酶活性十分微弱(20%和10%)。这一恶果与部分着手于嗜热古菌的核酸内切酶V并不一致[25-26]。
为进一步考据SacEndoV在高温下的酶活性，在镌汰反馈体系酶浓度的前提下同步测定了SacEndoV的活性和热褂讪性(图 4-B和图 4-C)。在75-95 ℃的高温下，跟着反馈时分的延伸，SacEndoV对底物的剪切率逐步增大。况兼在4-6 min的反馈时天职，不同反馈温度下扫数酶的底物剪切活性即达到足够。同期，在调换的反馈时天职，跟着反馈温度的升高，SacEndoV的底物剪切率小幅升高(图 4-B)。因此，SacEndoV如真实高温环境下具有很高的酶活性。此外，该恶果证明，图 3-A中，SacEndoV的底物剪切率干涉平台期，是由于在反馈体系中酶浓度较高的前提下，当反馈温度高于70 ℃，温度升高对酶活性的促进作用导致SacEndoV在15 min内险些将底物十足剪切(底物剪切率接近100%)，从而不同反馈温度间未阐明权贵的剪切活性各别。但是，跟着孵育时分的延伸，SacEndoV残余的酶活性却逐步镌汰(图 4-C)，标明SacEndoV在高温下保捏高酶活性有可能是酶集合底物后，增强了其褂讪性所致。
小77文学欣赏 2.5 SacEndoV对不同损害DNA底物的聘请性谈判标明，EcoEndoV和TmaEndoV均具有平日的底物谱[9， 13]。在此基础上，本谈判应用带有多样不同类型损害的DNA行动底物，探究SacEndoV的底物特异性(图 5)。如图 5-A所示，本谈判测定了SacEndoV关于带有3种脱氨基碱基，AP位点以及4种正常碱基的DNA底物的剪切活性，恶果标明其仅剪切含有脱氧肌苷的损害DNA底物。同期，一系列带有4种成例碱基扫数错配类型的双链DNA底物被用于测定SacEndoV的剪切活性(图 5-B和图 5-C)。恶果标明，SacEndoV对扫数包含错配位点的DNA底物均莫得可不雅察到的剪切活性。可见，不同于细菌着手的EcoEndoV和TmaEndoV，SacEndoV对含有脱氧肌苷的损害DNA底物具有极强的底物特异性。
2.6 底物中特定核苷酸结构圆善性对SacEndoV内切核酸酶活性的影响鉴于核酸内切酶V的典型活性，咱们推测DNA底物中脱氧肌苷3′端详邻的脱氧核糖核苷酸关于核酸内切酶V阐明剪切活性具有迫切兴味。因此，应用脱氧肌苷3′端详邻的脱氧核糖核苷酸被AP位点(无嘧啶/无嘌呤位点)替代的非常底物，本谈判探究了该核苷酸的结构圆善性是否对SacEndoV的剪切活性产生影响。图 6-A的恶果标明，SacEndoV对这类非常底物不具备权贵的剪切活性，且取代3′端脱氧核糖核苷酸的AP位点的类型对恶果无权贵影响。本谈判进一步测定SacEndoV对脱氧肌苷5′端详邻脱氧核糖核苷酸被AP位点取代的底物的剪切活性(图 6-B)。恶果标明，此类型的损害DNA底物关于SacEndoV的剪切活性无权贵影响。此外，在双链DNA景况下，关于该非常核苷酸结构不圆善所酿成的SacEndoV活性缺失，互补链上对应的成例核苷酸不具备浮现的抵偿效应(图 6-C)。因此，本谈判初步细目，与脱氧肌苷3′端详邻的脱氧核糖核苷酸结构圆善性关于SacEndoV识别并剪切相关底物极其要害。
3 贪图现存谈判仍是阐明核酸内切酶V在体外对损害DNA底物的剪切机制为水解位于脱氧肌苷3′端的第二个磷酸二酯键。据此，本谈判证实SacEndoV关于含脱氧肌苷的损害DNA阐明出典型的核酸内切酶V活性，相较于双链DNA底物，SacEndoV在体外对单链DNA底物具有浮现的偏好性。SacEndoV展现底物偏好性的推测原因为双链DNA的二级结构或者互补链上的配对碱基与氢键一定进程上险峻了SacEndoV搏斗并识别次黄嘌呤。古菌着手的核酸内切酶V中，TbaEndo V具有与SacEndoV一致的偏好性[25]，但此特质的生物学兴味需要在生物体内进行进一步的探究。此外，SacEndoV的底物谱特殊窄，仅对含有脱氧肌苷的损害DNA底物表现出剪切活性。就底物特异性而言，大部分古菌内切核酸酶V与SacEndoV一致[24-26]，但来自F. acidarmanus的双功能内切核酸V底物谱相对更广[27]。因此，除特殊规的内切核酸酶V外，古菌着手的核酸内切酶V倾向于对带有脱氧肌苷的损害DNA表现出极强的底物特异性。此外，除损害DNA底物，SacEndoV关于含I的RNA底物雷同具有剪切活性，这一特质与PfuEndoV以及东说念主类核酸内切酶V是一致的[23， 26]。鉴于核酸内切酶V相对非常的底物剪切机制，底物中除脱氧肌苷外，与脱氧肌苷的3′端详邻的脱氧核糖核苷酸是一个具有迫切兴味的核苷酸。基于本文的谈判恶果，该脱氧核糖核苷酸上碱基的存在关于SacEndoV剪切含脱氧肌苷的DNA底物是必要的，但尚不细目该核苷酸其他部分的圆善性是否也对酶的活性产生紧要影响。关于SacEndoV过火底物复合物晶体结构的阐明将有助于进一步阐明该表象的具体机制。
SacEndoV的生化表征标明，该核酸内切酶在70-95 ℃的温度范围内具有极高的剪切活性。这与S. acidocaldarius的最适助长温度相对一致，一定进程上展现建树物关于助长环境的相宜性。顶点嗜热古菌在高温环境中靠近着以更高的概率和速度发生DNA脱氨基作用的风险[30]。SacEndoV对损害DNA底物极高的剪切活性有助于S. acidocaldarius在高温环境下督察基因组的褂讪性。尽管SacEndoV在高温下具有极高的剪切活性，进一步谈判标明其在体外可能不具备细密的热褂讪性。由此推断，在高温导致其活性逐步丧失之前，SacEndoV极高的核酸内切酶活性确保其或者快速完成损害DNA底物的剪切。此外，SacEndoV展现这一特质的另一可能机制为SacEndoV与底物集合后，所形成的酶和底物的复合物的使得其本身的结构变得愈加褂讪。即底物的保护作用提升了SacEndoV的热褂讪性，使其在高温下保捏极高的底物剪切活性。
二价金属离子是核酸内切酶V督察底物剪切活性必要的扶植因子。SacEndoV在Mg2+，Mn2+，Ni2+和Co2+存在时阐明出典型的核酸内切酶V活性，但在Zn2+，Ca2+存在时则无法检测到剪切活性。关于扫数古菌着手的核酸内切酶V，Mg2+和Mn2+为有助于其督察较高核酸内切酶活性的两种典型辅因子。与SacEndoV相似，PfuEndoV[26]更偏好Mg2+行动辅因子，但关于TbaEndoV[25]而言，Mg2+和Mn2+对其活性的影响险些是一致的。此外，Ni2+行动辅因子时，SacEndoV和TbaEndo V[25]对含脱氧肌苷的DNA底物表现出剪切活性，但其对PfuEndoV[26]则不具备扶植作用。在Co2+存在的情况下，SacEndoV仍保捏相对微弱的底物剪切活性，而现在在其他的古菌核酸内切酶V中莫得不雅察到Co2+的扶植作用。可见，古菌核酸内切酶V需要二价金属离子行动扶植因子，但对二价金属离子类型的偏好性在不同物种之间略有不同。
核酸内切酶V在剪切含有脱氧肌苷的损害DNA后，仍会与底物保捏考究的集合[31]。此外，核酸内切酶V无法将脱氧肌苷从损害DNA中切除，因此核酸内切酶V需要招募其他的培植酶来完成脱氧肌苷后续的培植过程。天然现在关于脱氧肌苷后续培植过程的了解很少，但针对该非常培植路线建议了多种假说。一类假说建议，DNA团聚酶可能参与脱氧肌苷的切除培植。在大肠杆菌中，前东说念主报说念了一个触及核酸内切酶V，DNA团聚酶I和DNA畅达酶的脱氧肌苷培植模子。该模子中，DNA团聚酶I的3′-5′核酸外切酶活性在脱氧肌苷的去除中起主要作用[32-33]。在古菌中，不错识别次黄嘌呤的DNA团聚酶B被觉得与脱氧肌苷的培植相关，具体的培植机制仍有待证明[26]。特定的一些具有5′核酸内切酶活性的培植酶也被觉得或者协助脱氧肌苷的切除。古菌着手的核酸内切酶Q是一种新式核酸内切酶，其具备从损害碱基的5′端剪切含脱氧肌苷的DNA底物的催化活性[34]。因此，核酸内切酶Q具有与核酸内切酶V协同培植脱氧肌苷的后劲[25]。具有3′核酸外切酶活性的核酸酶是另一类协助切除脱氧肌苷的潜在培植酶。P. furiosus的AP核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease)具有3′-5′核酸外切酶活性，标明在核酸内切酶V剪切损害的DNA链后，其也许或者从缺口处切除脱氧肌苷[35]。当以Mn2+行动扶植因子时，TmaEndoV也表现出3′-5′核酸外切酶活性，但该性质似乎是TmaEndoV独到的[13]。
本谈判果决并表征了S. acidocaldarius内切核酸酶V福利姬 自慰，这是第一个关于Sulfolobus属着手的内切核酸酶V生化功能和酶学特征的谈判。S. acidocaldarius是谈判古菌在高温条款下督察基因组圆善性的时势菌株之一。因此，关于SacEndoV的谈判有助于丰富古菌着手核酸内切酶V的谈判内容，加深关于古菌核酸内切酶V的了解，也为进一步阐明S. acidocaldarius脱氧肌苷切除培植路线奠定了基础。